Использование тромбоцитарной аутоплазмы совместно с костными материалами для ускорения образования кости

Материал из wiki
Перейти к: навигация, поиск

В 1994 году Tayapongsak c соавт. предложил добавлять аутогенный фибриновый клей к губчатой кости при обширных реконструктивных вмешательствах на нижней челюсти. Рентгенографически была показана более ранняя консолидация кости в 33 случаях. Данный эффект объяснили улучшением остеокондуктивных свойств костного материала благодаря фибриновой сети аутогенного фибринового клея (АФК). Кроме того, авторы отметили большее удобство работы с материалом при смешивании его с АФК.

Tayapongsak c соавт. получали АФК из одной порции цельной крови, разделяя ее в лаборатории на эритроциты и плазму. Из плазмы готовили криопреципитат, который затем использовали в течение 2–3 недель. По мере необходимости размораживали нужное количество криопреципитата, получали из него 10–15 мл фибринового концентрата, который использовали в течение 24 часов.

С начала 1990-х годов наша группа исследовала более специфичный продукт — тромбоцитарную аутоплазму и влияние факторов роста, содержащихся в ней, на костный материал при проведении реконструктивных вмешательств на нижней челюсти.

Цель настоящей статьи заключается в представлении результатов исследований ТАП. По нашим данным, тром содержит, по меньшей мере, три фактора роста: тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста b1 (TGF–b1) и трансформирующий фактор роста b2 (TGF–b2). Кроме того, нам удалось выявить в губчатой кости клетки, имеющие рецепторы к вышеуказанным факторам роста.

В своем исследовании мы попытались определить способность ТАП увеличивать скорость формирования кости при использовании костных материалов, а также оценить плотность образующейся кости через 6 месяцев. Наконец, в настоящей работе мы попытались предложить модель регенерации кости, которая позволяет объяснить механизм количественного и качественного ускорения роста кости под влиянием ТАП. Материалы и методы

В исследовании участвовало 88 пациентов с обширными дефектами нижней челюсти (т.е. протяженностью 5 см и более), образовавшихся в результате удаления доброкачественных и злокачественных опухолей. Ни одному из пациентов не проводили лучевой терапии. Пациенты были разделены на две группы. В первой группе тромбоцитарную плазму не применяли. Во второй группе пациентов тромбоцитарную аутоплазму добавляли к губчатой кости, после измельчения последней в костной мельнице, а затем местно вводили в область пересадки костного материала. В обеих группах донорским участком служила задняя часть гребня подвздошной кости.

Тромбоцитарную аутоплазму получали с помощью клеточного сепаратора Electro Medics 500 (Medtronics) непосредственно в операционной при заборе кости. При использовании данного клеточного сепаратора проводили забор 450–500 мл аутогенной крови через центральный венозный катетер, который устанавливали во время операции. Кровь забирали со скоростью 50 мл/мин в центрифугу, которая вращается со скоростью 5600 об/мин. При заборе крови для предупреждения свертывания к ней автоматически добавляли консервант (цитро-глюкофосфат) в соотношении 1 мл консерванта на 5 мл крови. В центрифуге кровь разделяется на три основных составляющих: эритроциты, ТАП и обедненную тромбоцитами плазму. Это возможно благодаря различной плотности перечисленных составляющих. Сепаратор отделяет их по порядку — от наименее плотных к наиболее плотным. Так, первой отделяется обедненная тромбоцитами плазма (около 200 мл), затем тромбоцитарная аутоплазма (около 70 мл), последними остаются эритроциты (около 180 мл). После того как отделяется обедненная тромбоцитами плазма, скорость вращения центрифуги снижается до 2400 об/мин для более точного разделения ТАП и эритроцитов. По нашим данным, которые подтверждают Reeder с соавторами, самые молодые и наиболее активные тромбоциты тяжелее старых и поэтому смешиваются с наиболее легкими эритроцитами. Благодаря наличию в этой фракции эритроцитов, тромбоцитарная аутоплазма приобретает красноватую окраску, иначе она была бы соломенно-желтой.

Вся процедура длится 20–30 минут и обычно проходит во время забора аутогенной кости или подготовки принимающего ложа, а поэтому не влияет на общее время операции. Клеточный сепаратор компании Medtronics есть в большинстве операционных, где проводятся обширные ортопедические и кардиохирургические вмешательства, поэтому дополнительные расходы включали в себя только одноразовые трубки, венозный катетер и камеру для крови, что в сумме составило около $300.

Незначительное количество венозной крови и ТАП были взяты для определения формулы крови автоматическим счетчиком и ручным методом после окраски по Романовскому-Гимзе. Два дополнительных образца тромбоцитарной аутоплазмы были окрашены моноклональными антителами (Santa Cruz Technology). Один образец окрашен антителами к PDGF, а другой — к TGF–b. Образец аутогенной кости был помещен в формалин, затем деминерализован раствором муравьиной кислоты и окрашен моноклональными антителами к рецепторам PDGF и TGF–b.

Перед применением тромбоцитарной аутоплазмы в ней необходимо инициировать процесс коагуляции смесью из 10 мл 10%-го раствора хлорида кальция (CaCl2) и 10000 единиц бычьего тромбина (Gentrac) (здесь и далее по тексту эта смесь будет называться прокоагулянтом — прим. перев.). Для активации каждой новой порции ТАП необходимо использовать новый шприц. Это необходимо для предотвращения попадания остатков прокоагулянта из шприца в камеру для ТАП, поскольку даже незначительное его количество может привести к преждевременной коагуляции всего объема ТАП. В шприц набирают 6 мл ТАП, 1 мл прокоагулянта и 1 мл воздуха. Воздух необходим для перемешивания в шприце ТАП и прокоагулянта. Шприц покачивают 6–10 секунд до начала свертывания, а затем его содержимое смешивают с костным материалом. При смешивании ТАП с костным материалом фибрин склеивает его частички, что предотвращает их миграцию. Кроме того, полученный конгломерат пластичен — ему можно легко придать нужную форму. Известно также, что фибриновая сеть улучшает остеокондуктивные свойства костного материала. На 2, 4 и 6 месяцы после операции делали обзорные рентгеновские снимки, которые отдавали двум рентгенологам для слепой оценки возраста кости в области вмешательства. Таким образом, для каждого снимка были получены субъективный и истинный индексы зрелости кости. Через 6 месяцев в область вмешательства каждому пациенту установили, по меньшей мере, один имплантат (диаметром 4,0 мм). При подготовке ложа для имплантата получали образец кости диаметром 2,9 мм, после чего окрашивали материал моноклональными антителами к рецепторам PDGF и TGF–b и проводили гистоморфометрический анализ биоптата с помощью полуавтоматической компьютерной системы (SMI Unicomp). Эта система проецирует гистологическую картину на монитор, случайным образом выбирает участок кости, оцифровывает изображение, а затем подсчитывает площадь минерализованной кости по отношению к общей площади оцениваемого участка. Площадь минерализованной кости также называют площадью костных трабекул. Подобным образом был произведен гистоморфометрический анализ 10 образцов кости, взятых из участков нижней челюсти, прилежащих к области экстирпации. Результаты

Окраска моноклональными антителами ТАП

Тромбоциты ТАП на всех снимках интенсивно окрашены, что подтверждает наличие в них факторов роста и отсутствие повреждения тромбоцитов во время выделения. Окраска моноклональными антителами образца кости из области вмешательства На всех снимках кости из области вмешательства видны популяции клеток с рецепторами к факторам роста PDGF и TGF–b. В их размещении внутри кости наблюдалась определенная закономерность. Большинство клеток находилось вокруг сосудов. Меньшее количество клеток находилось на костных трабекулах губчатой кости, причем клетки были случайным образом распределены между жировыми клетками костного мозга (фото 1). Полученные результаты указывают на наличие в кости стволовых клеток и клеток-предшественников, которые способны реагировать на увеличение концентрации PDGF и TGF–b при применении тромбоцитарной аутоплазмы.

Образец кости окрашен моноклональными антителами TGF–b1r для выявления клеток, имеющих рецепторы к TGF–b1. Большинство клеток находится вокруг сосудов. Меньшая часть клеток находится на костных трабекулах губчатой кости. Антигенная детерминанта TGF–b RI (V–22) соответствует последовательности аминокислот со 158 по 179.

Подсчет количества тромбоцитов

Исходная концентрация тромбоцитов в крови пациентов в среднем составила 232 тыс./мкл и находилась в пределах от 111тыс./мкл до 523 тыс./мкл. Концентрация тромбоцитов в ТАП составила в среднем 785 тыс./мкл и находилась в пределах от 595 тыс./мкл до 1100 тыс./мкл. Это означает, что использованный метод секвестрации тромбоцитов позволил увеличить их концентрацию на 338% относительно исходного уровня (табл.1, фото 2 и 3).

Нормальное количество тромбоцитов в мазке периферической крови. Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение в 10 раз.

Тромбоцитов намного больше, чем в мазке периферической крови. Это значит, что в костном материале окажется больше факторов роста. Цитоплазматические гранулы (a–гранулы) содержат PDGF, TGF–b1, TGF–b2 и некоторые другие факторы роста.

Рентгенологическая оценка зрелости кости в области вмешательства

Результаты оценки панорамных снимков представлены в табл. 2. На 2 и 4 мес. в областях, где НЕ применяли ТАП, субъективный возраст кости был меньше истинного. Там же, но через 6 мес., субъективный возраст кости соответствовал истинному или несколько превышал его. На 2 и 4 мес. в областях, где применяли ТАП, субъективный возраст кости был выше истинного. При этом на второй мес. при оценке возраста кости эксперты ошибались в среднем в 2,16 раза, на четвертый мес. — в 1,88 раза, а на 6 мес. — в 1,62 раза (другими словами, 2-месячную кость принимали за 4-месячную, а 4-месячную — за 6-месячную). Затем был рассчитан индекс достоверности (индекс Стьюдента), он составил 0,001 (фото 4 и 5).

Гистологический анализ кости через 6 месяцев после операции. Окраска моноклональными антителами

Окраска моноклональными антителами показала, что в области вмешательства (с использованием ТАП и без нее) через 6 месяцев после операции продолжался синтез TGF–b. TGF–b — положительными клетками оказались остеобласты и стволовые клетки. Они находились преимущественно в губчатом веществе кости, в надкостнице и костном мозге. PDGF-положительных клеток было обнаружено крайне мало (фото 6).

Гистоморфометрический анализ кости через 6 месяцев после операции

Результаты гистоморфометрического анализа кости через 6 месяцев после операции показали, что площадь минерализованной кости в области вмешательства была больше чем в естественной кости дистальной части нижней челюсти (55,1% 8% и 38,9% 6% соответственно). Результаты представлены в табл. 3. Аналогичные результаты были получены и в других исследованиях. Однако, площадь минерализованной кости в области применения тромбоцитарной аутоплазмы была еще выше, чем там, где ее не применяли: 74,0% 11% и 55,1% 8% соответственно, p=0,005.

Эти результаты позволили предположить, что использование тромбоцитарной аутоплазмы в области вмешательства приводит к ускорению образования кости и увеличению её плотности. Наше исследование показало, что тромбоциты можно выделить и сконцентрировать вместе с PDGF, TGF-b и другими факторами роста, которые содержатся в их b-гранулах. Клеточный сепаратор разделяет кровь на отдельные фракции: эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и плазму, — чем отличается от систем, использованных в других исследованиях. Многие исследования показали наличие рецепторов к факторам роста у клеток губчатого вещества кости, что, возможно, и является причиной эффективности ТАП. Кроме того, доказано, что клетки, несущие на своей поверхности рецепторы к факторам роста, играют важную роль в регенерации кости.

Клетки с рецепторами к факторам роста (по данным Caplan7 — стволовые клетки) в основном находятся в периваскулярном пространстве, как и предполагалось многими авторами. Внутри собственно кости эти клетки представлены остеобластами и преостеобластами, которые, как известно, активируются PDGF и TGF-b. Наконец, стволовые клетки равномерно рассеяны в костном мозге.

Обсуждение

Природа PDGF и TGF-b

PDGF. Полученный из тромбоцитов фактор роста представляет собой гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 30 kd. Несмотря на то, что этот фактор роста был впервые обнаружен в b–гранулах тромбоцитов, PDGF секретируется и другими клетками, например, макрофагами и эндотелиальными клетками. Тромбоциты первыми оказываются в месте повреждения, поэтому PDGF является первым фактором роста, который попадает в рану, вызывая реваскуляризацию, синтез коллагена и регенерацию кости. У человека PDGF существует большей частью в виде гетеродимера, состоящего из двух цепей (А и В) примерно одинакового размера и с одинаковой молекулярной массой (приблизительно 14–17 kd). В тромбоцитах человека содержатся и гомодимеры, представленные цепями А–А и В–В, причем эти гомодимеры обладают той же активностью, что и гетеродимер. Биологический смысл существования димерных форм PDFG не вполне понятен, предполагается, что на эндотелиоцитах, фибробластах, макрофагах и стволовых клетках костного мозга имеются специфические рецепторы к ним.

PDGF появляется в месте повреждения в результате дегрануляции тромбоцитов. Молекулярные основы действия факторов роста выглядят следующим образом. Молекула фактора роста связывается с рецептором на клеточной стенке. В результате связывания происходит активация вторичного посредника. Этот сигнальный протеин в свою очередь запускает цепь реакций, приводящих к экспрессии гена, который регулирует специфическую активность в клетке-мишени. Например, митоз (приводит к увеличению популяции клеток, участвующих в заживлении), ангиогенез (митоз эндотелия сосудов с образованием новых функционирующих капилляров) и активация макрофагов (очищают рану и являются источником факторов роста на втором этапе заживления).

В одном миллионе тромбоцитов содержится приблизительно 0,06 нг PDGF. Это соответствует 6 х 10–17 г PDGF или приблизительно 1200 молекул PDGF в каждом тромбоците. Такое количество подчеркивает потенциал PDGF для улучшения заживления ран мягких тканей и кости, особенно при увеличении числа тромбоцитов благодаря использованию ТАП.

TGF–b. Термин "трансформирующий фактор роста b" применяется к огромной группе факторов роста. Костный морфогенетический протеин (КМП) — один из представителей этой группы, причем существует 13 видов различных костных морфогенетических протеинов. В настоящей статье термином TGF-b называют два белка, TGF–b1 и TGF–b2, выполняющие множество функций при регенерации соединительной ткани и кости. TGF–b1 и TGF–b2 имеют молекулярную массу около 25 kd. Подобно PDGF они синтезируются тромбоцитами, макрофагами, а также некоторыми другими видами клеток. В рану они попадают благодаря дегрануляции тромбоцитов или секреции макрофагов. Действуют по паракринному типу, т.е. на близлежащие клетки, большей частью на фибробласты, преостеобласты и стволовые клетки костного мозга. В свою очередь любая из перечисленных клеток-мишеней тоже синтезирует факторы роста, которые могут действовать паракринно и (или) аутокринно. Аутокринное действие предполагает действие вещества (в данном случае фактора роста), синтезированного клеткой, на эту же самую клетку. Такой механизм отвечает за столь длительный эффект факторов роста и объясняет, почему факторы роста ускоряют не только регенерацию, но и созревание кости. Наиболее важной функцией TGF–b1 и TGF–b2 является стимуляция хемотаксиса и митоза предшественников остеобластов, а также синтеза коллагеновой матрицы. Кроме того, TGF–b подавляет образование остеокластов и их активность, способствуя формированию более плотной кости.

Модель регенерации кости при использовании костного материала

Уже имевшаяся информация и новые факты о функции факторов роста позволяют сформулировать модель регенерации кости при трансплантации губчатой кости. На этой модели видно, как TGF–b и PDGF участвуют в нормальной регенерации, а также почему увеличение их концентрации в ТАП приводит к ускорению регенерации и улучшению качества регенерируемой кости.

Материал для трансплантации (в данном случае губчатую кость) помещают в костный дефект (при синус-лифтинге или при обширном дефекте нижней челюсти или при любом другом дефекте), заполненный сгустком крови. Область раневого дефекта характеризуется низким напряжением кислорода (рО2= 5–10 мм ртутного столба), ацидозом (рН=4–6), в ней содержатся тромбоциты, лейкоциты, эритроциты, фибрин, а также остеоциты, остеобласты и стволовые клетки, которые мигрируют в кровяной сгусток из прилежащей костной ткани (рис.10). Стволовые клетки являются источником регенерации, однако находятся в очень низкой концентрации (у 50-летнего человека приблизительно 1 стволовая клетка на 400 тысяч дифференцированных клеток). Описанный выше механизм, упрощенный в нашей модели, является результатом миллионов лет эволюции. Он запускает и поддерживает процесс костной регенерации, а также способствует созреванию кости. В настоящее время хирурги могут использовать этот механизм для регенерации кости при использовании костного материала. Основные клетки, факторы роста и биохимические показатели внутри и вне области вмешательства. На третий день под влиянием TGF-b и PDGF начинается реваскуляризация. Под влиянием этих же факторов роста недифференцированные клетки делятся и создают популяцию клеток, способных синтезировать достаточное количество новой кости. Макрофаги становятся основным источником факторов роста к моменту, когда их запас в тромбоцитах полностью исчерпан. На 14 сутки реваскуляризация практически полностью завершена. Клетки синтезируют новую кость, их активность регулируется аутокринным механизмом. По мере нормализации перфузии области вмешательства, макрофаги из нее исчезают

Костная регенерация начинается с высвобождения PDGF и TGF–b во время дегрануляции тромбоцитов. PDGF стимулирует митоз стволовых клеток и остеобластов, которые находятся в области костной подсадки, увеличивая их число на несколько порядков. Он также стимулирует ангиогенез (прорастание сосудов в область вмешательства) за счет стимуляции митоза эндотелия сосудов. TGF–b активирует фибробласты, стимулирует митоз и дифференцировку предшественников остеобластов. Продолжающаяся секреция TGF–b стимулирует синтез костной матрицы остеобластами и коллагеновой матрицы фибробластами, благодаря чему создается опора для прорастающих сосудов. Прорастающие сосуды можно обнаружить в области вмешательства уже на третьи сутки, а полная васкуляризация происходит на 14–17 сутки (рис.11 и 12).

Увеличение клеточной активности в начале регенерации является результатом действия многих факторов роста, но главными среди них считают PDGF и TGF–b. Энергетически это наиболее выгодная схема регенерации, поскольку не нужно содержать большое количество недифференцированных (стволовых) клеток, единственной функцией которых является замена утраченных клеток. В ходе эволюции у млекопитающих исчезла необходимость содержать их в больших количествах (1 х 100 тыс. у подростков, 1 х 250 тыс. у 35-летних, 1 х 400 тыс. у 50-летних, 1 х 1120 тыс. у пациентов в возрасте 80 лет). Вместо этого появилась способность увеличивать их число при повреждениях за очень короткий промежуток времени.

Период непосредственного влияния факторов роста, синтезированных тромбоцитами, на регенерацию составляет 5 дней. Поддержание активности регенерации свыше этого срока обеспечивается двумя механизмами. Первый — трансформация стволовых клеток в остеобласты, которые сами синтезируют TGF–b. Второй, более мощный — хемотаксис в область вмешательства макрофагов и замещение ими тромбоцитов как источника факторов роста. На третьи сутки именно они становятся основным источником факторов роста. Хемоаттрактантом для макрофагов является PDGF. Кроме того, они перемещаются по градиенту напряжения кислорода большему, чем 20 мм ртутного столба. Напряжение кислорода в здоровых тканях составляет 45–55 мм ртутного столба, а в области вмешательства — всего 5–10 мм ртутного столба. Таким образом, градиент напряжения кислорода между областью вмешательства и прилегающими тканями составляет 30–40 мм ртутного столба. По мере того, как влияние PDGF уменьшается, влияние макрофагальных факторов роста и факторов роста сосудов увеличивается. Впрочем, действие макрофагальных факторов роста и факторов роста сосудов может быть идентично PDGF, только синтезируются они не тромбоцитами, а макрофагами. Стволовые клетки синтезируют TGF–b и стимулируют, таким образом, свою собственную активность. В нашем исследовании мы подтвердили эти данные (фото 6). Через 4 недели область вмешательства оказывается полностью реваскуляризованной, и градиент напряжения кислорода, необходимый для поддержания активности макрофагов, исчезает. Макрофаги покидают эту область, поскольку кость, хотя и является все еще незрелой, способна сама поддерживать дальнейший процесс регенерации.

Образование зрелой кости с системой гаверсовых каналов включает в себя участие третьей группы факторов роста, которые не отражены в нашей модели и не содержатся в тромбоцитарной аутоплазмк. Речь идет о костном морфогенетическом протеине. По мере того, как остеобласты формируют и минерализуют костную матрицу, в ней откладывается костный морфогенетический протеин26. Этот кислотоустойчивый белок высвобождается при резорбции кости остеобластами в ходе процесса нормального ремоделирования кости. Данный процесс происходит и в зрелой кости со скоростью 0,7% объема кости в день, но в созревающей кости в области вмешательства он идет интенсивнее — от 5 до 8% в день. Благодаря КМП процессы синтеза и резорбции костной ткани тесно связаны друг с другом. Этот белок стимулирует митоз и дифференцировку стволовых клеток, которые прилежат к участку резорбции, в функционирующие остеобласты, секретирующие костную матрицу. Таким образом, процесс образования кости в области вмешательства завершается и переходит в самоподдерживающийся цикл резорбции и ремоделирования зрелой кости.

Выводы

Имеющаяся информация о регенерации костной ткани указывает на решающую роль факторов роста в успехе хирургических вмешательств. В настоящей статье освещен механизм действия двух основных факторов роста: TGF–b и PDFG. Увеличение концентрации этих факторов роста методом выделения и концентрирования тромбоцитов (т.е. получения ТАП) является доступным и эффективным методом сокращения сроков регенерации кости. Использованный метод получения аутогенной ТАП непосредственно перед операцией полностью исключает риск развития аллергических реакций и переноса инфекционных заболеваний. В настоящем исследовании показано, что ТАП содержит высокие концентрации тромбоцитов и факторов роста, а также, что в аутогенной кости имеются клетки-мишени для факторов роста. Наконец, нами было продемонстрировано, что смешивание факторов роста с костным материалом позволяет получить качественно и количественно лучший результат по сравнению с отсутствием факторов роста. Авторы подчеркивают, что PDGF и TGF-b не являются единственными факторами роста, содержащимися в тромбоцитарной аутоплазме или участвующими в процессе регенерации. Представленная в статье модель регенерации сильно упрощена, однако позволяет хирургу планировать стратегию использования ТАП.

Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1998; 85:638-46 Robert E. Marx, DDS, Eric R. Carlson, DMD, Ralph M. Eichstaedt, DDS, Steven R. Schimmele, DDS, James E. Strauss, DMD, Karen R. Georgeff, RN,

Медицинский факультет университета Майами Перевод: Е.Ханин