Просмотр исходного текста страницы Выявление КI-67-позитивных клеток в эпидермисе и сально-волосяном комплексе кожи головы до и после лечения ТАП

Р. Ахмеров, доктор медицинских наук, профессор
Р. Зарудий, кандидат медицинских наук
Л. Мусина, доктор биологических наук
О. Короткова, врач дерматкоосметолог
А. Ибатуллина
Р. Хабибуллина
А. Хафизова
Клиника «Счастливая семья», Москва, 
Клиника «Гелиосити», Уфа, Россия

==Реферат==

С целью выяснения эффективности лечения диффузной алопеции тромбоцитарной аутологичной плазмой проведено иммуногистохимическое исследование образцов кожи головы 8 пациентов с данным видом алопеции, взятых у них до и после проведения указанного лечения. Установлено, что после лечения тромбоцитарной аутологичной плазмой в коже головы пациентов значительно повышается количество Ki-67-позитивных пролиферирующих стволовых клеток волосяных фолликул.

==1. ВВЕДЕНИЕ==

В основе нарушения роста волос (их поредения различной степени выраженности) и облысения, или алопеции (прогрессирующего патологического выпадения волос), лежат многочисленные эндогенные и экзогенные факторы [3, 11]. При сохранении клеток-«прародителей» и их нормальном функционировании возможна регенерация волосяных фолликулов (ВФ), так как известно, что одна из основных функций ВФ – служить источником стволовых клеток (СК), обеспечивающих рост волос и обновление эпидермиса [1, 4]. Установлено, что СК распределяются по всей нижней части ВФ, там они делятся и созревают (дифференцируются), дают поколения собственных фолликулярных клеток и постоянно мигрируют из фолликула, поставляя исходные (прогениторные) клетки для кератиноцитов [6]. По мере того, как эти клетки продвигаются вверх, в направлении просвета, соединяющего фолликул с поверхностью, они проходят процесс кератинизации и становятся волосом. Выявить СК во время их размножения (пролиферации) можно с помощью иммуно-гистохимических реакций с применением моноклональных антител [2]. Быстро развивающаяся биология волос и связанная с ней молекулярная биология СК помогают понять механизмы роста волос и открывают путь к новым методам лечения алопеции.
Использование PRP (Platelet Rich Plasma)-терапии в медицине началось с 1998 года [14], несколько позже стали применять инъекционную форму PRP-терапии [9]. Получение тромбоцитарной аутологичной плазмы (ТАП) включает отделение тромбоцитов и соответственно содержащихся в них факторов роста. Упрощенно говоря, стратегия применения ТАП состоит в улучшении и ускорении процессов, вызываемых содержащимися в тромбоцитах факторами роста. Кроме того, ТАП модулирует и регулирует функцию первичных факторов роста в присутствии вторичных и третичных. Тромбоциты запускают природные механизмы регенерации и лечения, стимулируя рост и деление новых здоровых клеток [10].

==2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ==

Целью исследования было выявление пролиферирующих (делящихся) СК в коже головы пациентов до и после лечения диффузной алопеции тромбоцитарной аутологичной плазмой.
Материалы и методы. В исследовании участвовали 8 пациентов-волонтеров с диагнозом «диффузная алопеция». Все пациенты были женского пола в возрасте от 30 до 55 лет. В течение 4 месяцев им проводили лечение алопеции с помощью инъекций тромбоцитарной аутологичной плазмы.
Объектом исследования служили кусочки кожи головы пациентов-волонтеров (с их согласия), полученные при биопсии до и после проведенного лечения. Кусочки ткани размером 2х2 мм фиксировали в 10%-ном растворе забуференного формалина по Лилли (рН 7,2) с последующей заливкой в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике.
Для иммуногистохимического выявления ядерного белка пролиферирующих клеток использовали непрямой метод связывания моноклональных антител мышей с антигеном Ki-67 (NCL-Ki67-MM1, 1:200, Novocastra). В качестве источника дополнительных (вторых) антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные антимышиные иммуноглобулины.
Визуализацию проводили окрашиванием с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit) и последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты производства компании Novocastra). Срезы докрашивали гематоксилином.
Для оценки результатов и микрофотографирования гистологических и иммуногистохимических препаратов использовали световой микроскоп LSM 5 PASCAL (Carl Zeiss, Германия) и программу по анализу изображений AxioVision (Carl Zeiss, Германия). При увеличении микроскопа Х200 в поле зрения (по 30 полей зрения на препаратах каждого пациента) подсчитывали количество Ki-67-позитивных клеток в сетчатом слое дермы кожи.
Математико-статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы «Statistica» 7.0. Для сравнения показателей (переменных) применяли метод параметрической статистики t-критерия Стьюдента.

==3. РЕЗУЛЬТАТЫ==

При сравнении гистологических препаратов кожи головы была хорошо видна разница между состоянием кожи до и после лечения диффузной алопеции. После лечения в коже головы пациентов увеличивалась плотность волосяных фолликулов на единицу площади. Этот факт визуализировался на препаратах даже без выполнения количественных исследований (рис.1).

[[Файл:Alskdjfhg123.png]]

Рис. 1. Гистологические срезы кожи головы пациентки Х. А. Образец кожи до лечения. В поле зрения единичные волосяные фолликулы (ВФ). Реакция на выявление Ki-67 положительных клеток выражена слабо. Докраска гематоксилином. Ув. Х100. Б. Образец кожи после лечения. Заметно увеличилось количество волосяных фолликулов (ВФ) на единицу площади. Хорошая реакция на выявление Ki-67-позитивных клеток при докраске гематоксилином. Ув. Х100.

Иммуногистохимическое исследование показало, что на препаратах кожи головы пациентов до лечения большинство клеток наружного и внутреннего корневых эпителиальных влагалищ волосяных фолликулов проявляли отрицательную реакцию на наличие Ki-67-, позитивных ядер (синие после окрашивания гематоксилином неделящиеся клеточные ядра) (рис. 2А), что свидетельствовало об их нахождении в состоянии покоя. Напротив, после лечения в базальном и супрабазальном слоях наружного корневого эпителиального влагалища волосяной луковицы в волосяных фолликулах в большом количестве определялись коричневые Ki-67-позитивные ядра пролиферирующих клеток (рис. 2Б).

[[Файл:Alskdjfhg1234.png]]

Рис. 2. Гистологические срезы кожи головы пациентки Н. А. Образец кожи до лечения. Пролиферирующие клетки в эпителиальных влагалищах волосяных фолликулов (ВФ) отсутствуют. Синие точки – неделящиеся клеточные ядра. Выявление Ki-67-позитивных ядер выполнено с докраской гематоксилином. Ув. Х200. Б. Образец кожи после лечения. Положительная реакция на выявление Ki-67-позитивных ядер (коричневых точек) в волосяных фолликулах (ВФ). Докраска гематоксилином. Ув. Х200.

Подсчет Ki-67-позитивных ядер показал, что среднее количество пролиферирующих клеток на одно поле зрения микроскопа в коже головы пациентов после лечения составило 107,6918,80, в то время как до лечения оно составляло 8,501,88 (р<0,001).
На гистологических срезах тканей кожи встречались участки волосяного матрикса, сплошь состоящие из скоплений пролиферирующих клеток с коричневыми Ki-67-позитивными ядрами (рис. 3). Матрикс волосяной луковицы – это зона роста, сформированная из активно делящихся СК. В коже пациентов до лечения такие клеточные скопления выявлялись редко.

[[Файл:Alskdjfhg12345.png]]

Рис. 3. Гистологический срез кожи головы пациентки Г. после лечения. Положительная иммуногистохимическая реакция на выявление Ki-67-позитивных клеток (коричневых точек) в области матрицы волосяного фолликула. Докраска гематоксилином. Ув. Х400.

Известно также, что СК располагаются и в сальных железах, примыкающих к волосяному фолликулу. В базальных и супрабазальных участках сальных желез пролиферирующие клетки чаще визуализировались в коже пациентов после лечения, чем до него (рис. 4).

[[Файл:Alskdjfhg123456.png]]

Рис. 4. Гистологические срезы кожи головы пациентки С. А. Образец кожи до лечения. Низкое содержание Ki-67-позитивных ядер (коричневых точек) в сальных железах (СЖ). Докраска гематоксилином. Ув. Х400. Б. Образец кожи после лечения. Высокое содержание Ki-67-позитивных ядер (коричневых точек) в сальных железах (СЖ). Докраска гематоксилином. Ув. Х400.

Нужно отметить, что ядра клеток базального и шиповатого слоев эпидермиса кожи головы интенсивно экспрессировали выявляемый антиген, что также свидетельствовало об усилении регенераторных процессов в коже головы пациентов после лечения.

==4. ОБСУЖДЕНИЕ==

Полученные результаты свидетельствуют о том, что после лечения диииффффузной алопеции тромбоцитарной аутологичной плазмой в волосяных фолликулах и сальных железах кожи головы пациентов значительно повышается количество Ki-67-позитивных пролиферирующих клеток. Это говорит о непосредственном участии стволовых клеток в восстановительных процессах, обеспечивающих рост волос. Цитокин Ki-67 – это ядерный белок, выявляемый в ядрышках и за их пределами в связанном состоянии (вместе с хроматиновыми белками) и являющийся антигеном, ассоциированным с фазами клеточного цикла митоза [7, 13]. Его экспрессия наступает во время пресинтетической фазы, нарастает в течение клеточного цикла в периодах G1, S и G2 и уменьшается в фазе митоза [2]. Он не обнаруживается в интерфазфазных ядрах во время покоя клетки [5].
Для активации СК нужны цитокины, различные факторы роста и сигнальные молекулы, синтез которых регулируется, как известно, самими СК и клетками их микроокружения, так называемой «ниши» [12, 15]. CК не работают, т.е. не активизируются и не размножаются без сигнальных молекул микроокружения. Следовательно, чтобы имитировать процесс, происходящий при нормальном морфогенезе волосяных фолликулов, нужно создать соответствующие условия для клеток микроокружения. Возникает необходимость внесения «внешнего» стартового сигнала для обновления клеток [8]. При лечении тромбоцитарной аутологичной плазмой таким внешним сигналом, вероятно, является активация тромбоцитов (выделение из них факторов роста). Именно она приводит к начальной агрегации тромбоцитов и высвобождению из них ряда веществ (АДФ, серотонина, адреналина, нестабильных простагландинов, тромбоксана А2, тромбоцит-активирующего фактора), служащих сильными стимуляторами активности стволовых клеток.

==5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ==

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что подкожное введение тромбоцитарной аутологичной плазмы вызывает стимуляцию пролиферации стволовых клеток волосяных фолликулов, обеспечивая рост волос и обновление эпидермиса. Исходя из этого, применение тромбоцитарной аутологичной плазмы можно рекомендовать к широкому применению в клинической практике для лечения алопеции различного генеза.

==Литература==

Воротеляк ЕА. Регенеративный потенциал волосяного фолликула. Обзор научных изысканий. Пластическая хирургия и косметология,– 2010;(1):118–123.

Кирик ОВ, Безнин ГВ, Коржевский ДЭ. Маркеры пролиферации, применяемые в гистологических исследованиях. Морфология,– 2009;136(6):95–100.

Мазитова Л. Влияние эндокринных, метаболитических и химических факторов на выпадение волос и их структуру у женщин. Les Nouvelles Esthetiques. Русское издание. 2002;(1):40–42.

Пальцев МА, Терских ВВ, Васильев АВ. Что есть стволовая клетка. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Т.1. Под. ред. Пальцева МА. – М.: Медицина, Шико, 2009. С.13–30.

Bromley M, Rew D, Becciolini A, et al. A comparison of proliferation markers (BrdUrd, Ki-67, PCNA) determined at each cell position in the crypts of normal human colonic mucosa. Eur J Histochem,1996;40:89–100.

Elliott K, Stephenson TJ, Messenger AG. Differences in hair follicle dermal papilla volume are due to extracellular matrix volume and cell number: implications for the control of hair follicle size and androgen responses. J Invest Dermatol,1999;113:873–877.

Endl E, Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. Exp Cell Res, 2000;257(2):231–237.

Fernandes KJ, McKenzie IA, Mill P, et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat Cell Biol, 2004;(6):1082–1093.

Froum SJ, Wallace SS, Tarnow DP, Cho SC. Effects of platelet-reach plasma on bone growth and osseintegration in human maxillary sinus grafts: Three bilateral case reports. Int J Periodontics Restorative Dent, 2002;(22):45–53.

Greenlagh DG. The role of growth factors in wound healing. J Trauma, 1996;(41):159–167.
Harrison S, Bergfeld W. Diffuse hair loss: its triggers and management. Cleve Clin J Med,– 2009;6(76):361–367.

Jahoda CА, Reynolds AJ. Hair follicle dermal sheath cells: Unsung participants in wound healing. Lancet,– 2001;358:1445–1448.

Kreitz S, Fackelmayer FO, Gerdes J, Knippers R. The proliferation-specific human Ki-67 protein is a constituent of compact chromatin. Exp Cell Res,– 2000;261(1):284–292.

Marx RE, Carlson ER, et al. The reach platelet plasma is the source of autogenic growth factors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, Oral Radiol Endod, 1998;(85):638–646.

Polak RML, Fuchs E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes & Development,– 2008;(22):543–557.

[[Категория:Трихология]]